Avances en la Restauración del Sistema Nervioso.
México, D.F. (1994)
Estudios preclínicos de la administración del factor de crecimiento fibroblástico en daño cerebral.
Avances en la Restauración del Sistema Nervioso.
México, D.F. (1994)
Introducción
El factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF), es una molécula protéica con efecto trófico sobre neuronas del sistema nervioso central (SNC), forma parte de la familia de 7 miembros, los cuales comparten entre el 40 y 60 porciento de homología en secuencia de aminoácidos (aa), los mejores caracterizados son el ácido (aFGF) y el básico (bFGF), los otros 5 son el (kFGF), (Int-2), (FGF-5), (FGF-6) y el (KGF).
Los bFGF y aFGF, muestran un rango similar de actividad biológica, pero dirieren algunas de sus propiedades fisico- químicas así como en su distribución tisular.
El bFGF tiene un punto isoeléctrico (PI) de 9.6 y se identificó por fibroblastos 3T3 de donde se deriva su nombre.
El aFGF tiene un punto isoeléctrico (PI) de 5.6 y se identificó por causar proliferación en los mioblastos y en células endoteliales.
Estructura y purificación del fgf
Ambos factores han sido purificados totalmete. Entre las diversas metodologías desarrolladas para el aislamiento de estos factores, la más utilizada toma ventaja de la alta afinidad de estos por la heparina y consiste en un procedimiento de 3 pasos fundamentales, que incluyen precipitación por sulfato de amonio, cromatografía sephadex y cromatografía de afinidad de hepari-sepharosa, este último paso por sí mismo es responsable de una purificación de 2000 a 5000 veces.
Nuestro grupo IINEDEC desarrolló un método de purificación que incluye homogeización, centrifugación, ultrafiltración tangencial y cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).
En el último paso el cromatograma preparativo muestra 4 grandes fracciones (figura 1a), las cuales al ser estudiadas en columna análitica y comparadas con FGF comercial (FGFC) utilizado como referencia, mostraron que la fracción IV (F-IV) (figura 1b) y el FGFC (figura 1c) tienen el mismo tiempo de retención (TR); la pureza de acuerdo al cromatograma analítico fué mayor del 99 %.
El bFGF es un péptido de cadena sencilla que en su forma más completa está compuesto de 154 aminoácidos (aa); existen múltiples formas truncadas, la más común es la de 146 aminoácidos y es casi tan potente como la nativa, deduciéndose que la región perdida no es indispensable para la actividad biólogica.
El aFGF consta también de una cantidad similar de aminoácidos (aa); con múltiples formas truncadas, la más común es la de 140. El Peso Molecular (PM) de ambos factores varía de acuerdo a la a la truncación entre 15.6 y 17.8 Kilodaltons (Kda), la F-IV mostró un peso melecular de 16 Kda en geles de poliacrilamida y fué inmunoreactiva a anticuerpos anti-aFGF y anti-bFGF.
Una homología débil existe entre éstos péptidos con Interlukina “1b” y otros factores de crecimiento (aproximadamente un 25% ).
La forma ácida se ha conservado muy bien a través de la evolución , por lo que el bovino y el humano sólo difieren en 2 aminoácidos, dando una homología del 98.7 %, siendo mayor que la de Insulina para ambas especies.
Genes para los fgf
El alto grado de homología entre las formas ácida ( aFGF ) y básica (bFGF), sugiere que derivan de un gen ancestral sencillo.
En los seres humanos el que codifica para el ácido ( bFGF ) se localiza en el cromosoma 4 y para el básico (aFGF), se localiza en el cromosoma 5.
Distribución y síntesis del fgf
El bFGF ha sido aislado de tejidos derivados de mesodermo y neuroectodermo, los cuales muestran ser sensibles a éste factor tanto en “in-vitro” como “in-vivo”, incluyendo a cerebro, hipófisis, retina, cuerpo lúteo, glándula suprarenal, riñón, placenta, próstata, timo, hueso, sistema inmunológico (macrófagos y monocitos), etc.
Nuestro grupo IINEDEC utiliza al cerebro fetal bovinocomo fuente del “fgf”.
La forma ácida se ha localizado en cerebro, retina y mas recientemente en hígado, es de 30 a 100 veces menos potente que la básica.
La mayoría de los órganos de los cuales el bFGF se ha purificado, muestran en común potencial angiónico fuerte y alta vascularización, esto sugiere que las células del sistema vascular pueden ser la fuente más importante del bFGF, ya que además de expresar la actividad del gen para éste factor, producen su forma activa.
Estudios recientes en tejidos humanos sanos han mostrado que el bFGF está presente en cantidades altas en membrana basal, células endoteliales y musculares lisas de vasos sanguineos del sistema nervioso, en especial cortesa cerebral y tálamo, medianas cantidades en vasos de cerebelo, médula espinal y meninges; se localiza también en vasos de piel, sistema hematopoyético, bronquios (altas cantidades), alveolos, hígado, intestinos delgado y grueso, riñón, ureteros, vegiga, cervix y útero.
Además está presente en células parenquimatosas del sistema nervioso central (SNC), (neuronas, células de Purkinje, pero no en células gliales), glándulas sudoríparas, epitelio bronquial, células musculares esqueleticas lisas y de miocardio.
En ratas adultas se ha localizado en neuronas de corteza, hipocampo y tallo cerebral. Las células gliales “in-vitro” frecuentemente expresan al bFGF, pero raramente “in-vivo”. Algunos tumores como neuroblastomas y gliomas también expresan el bFGF.
Receptores al fgf
Todos los tipos celulares que responden al FGF “alfa” y “beta”, expresan receptores específicos a éste Factor en la membrana celular, algunas evidencias sugieren que ambos factores pueden enlazar al mismo receptor, también se ha visto que el bFGF y el aFGF, no enlazan receptores para otros factores de crecimiento, así mismo ninguno de los otros factores de crecimiento enlaza a los receptores del FGF.
Cuando el receptor presente en la superficie de la membrana celular enlaza al FGF se inicia un proceso de internalización lento. En contraste a otros mitógenos el FGF no es degradado por la célula, tampoco la fosforilacíoacute;n de tirosina del receptor es tan rápida.
La adición de este factor a células cultivadas en reposo del tipo “3T3″, induce en minutos la formación de diacilglicerol, activación de proteinkinasa C y movilización de calcio.
Utilizando células endoteliales vasculares en cultivo se han estudiado los efectos tempranos del bFGF, se observa a las 3 horas un aumento en la permeabilidad y plegamiento de la membrana, modificándose la estructura del citoesqueleto.
La inducción de la respuesta pleiotípica y mitógena por el bFGF ha sido analizada utilizando cultivos en reposo “3T3″, mostrando todos los eventos pleiotípicos observados después de la adición del suero fetal.
Este factor regula la expresión de genes celulares, en particular del “c-fos” y “c-myc” los cuales previamente han mostrado que están relacionado con la diferenciación y proliferación normal.
La aparicion muy rápida de ácido ribonucleíco (RNA) mensajero del “c-fos” así como la presencia de proteínas después de la estimulación con bFGF, sugiere que el “c-fos” está involucrado en un efecto directo, mientras que la activación de “c-myc” puede ocurrir a través de mecanismos indirectos.
Efectos biológicos del fgf “IN-VITRO” sobre neuronas y Glia
Los efectos que más llaman la atención del bFGF sobre neuronas en cultivo, son la estimulación de sobrevivencia y crecimiento neurítico, dándose estos efectos sobre neuronas fetales de corteza cerebral (Morrison et al 1986; Walicke, 1988), hipocampo (Walicke et al 1986), tálamo, cuerpo estriado, septum (Walicke, 1988) y mesencéfalo (Ferrari et al 1989) entre otros.
La sobrevivencia y el crecimiento de neuritas requiere de la contínua presencia del bFGF, éste efecto también se ha reportado sobre neuronas postnatales de la mayoría de los rengiones mencionadas.
El bFGF incrementa la actividad de la colin-acetiltransferasa (CAT) en neuronas de septum.
La F-IV aislada por nuestro grupo IINEDEC y que previamente había mostrado igual tiempo de retención (TR) y peso molecular (PM) que el FGF de referencia, aumentó significativamente la sobrevivencia y elaboración de neuritas en neuronas de cortesa cerebral de fetos de rata de 16 días de gestación, a los 3 y 6 días de evaluación.
Este efecto fué bloqueado significativamente cuando se agregaron anticuerpos monoclonales (ACM) contra el bFGF y se mantuvo sin cambios cuando se agregaron anticuerpos monoclonales (ACM) contra el aFGF (Aguilar et al 1993), lo cual sugiere que al menos la actividad neurotrófica “in-vitro” de la F-IV depende sólo del bFGF (figura 2).
Efectos biológicos del fgf “IN-VIVO”
La administración de bFGF a embriones de pollo entre los 8 y 14 días, previene completamente la muerte de neuronas del ganglio ciliar, la cual ocurre en éste período (se pierde aproximadamente un 46% de neuronas).
La sección de la fimbria-fornix genera muerte neuronal en el septum y la aplicación de bFGF la reduce significativamente (Anderson et al 1988); además, evita disminución en la actividad de la colin-acetiltransferasa (CAT) en hipocampo y aumenta el número de astrocitos reactivos en las cercanías de la lesión.
La administración local en cuerpo estriado recupera parcialmente el déficit de los niveles de dopamina y las alteraciones morfológicas de neuronas dopaminérgicas en ratones tratados con (MPTP) (análogo de meperidina) (Otto y Unsicker et al 1990). La forma ácida también ha mostrado efectos similares en el mismo modelo (Date et al 1990).
Estudios realizados por nuestro grupo IINEDEC con la F-IV, (la cual de acuerdo al estudio comparativo de cromatogramas analíticos con el Factor de Crecimiento Comercial (FGFC) (está constiyuída por el bFGF 72% y aFGF 28%), en ratas con daño cerebral inducido por “hipóxia-isquemia” (hipóxia-isquemia-ligadura de carótida izquierda y exposición a 8% de Oxígeno), a los 9 días de edad, mostraron que la administración intramuscular (IM) de 12 µg/kg, diariamente durante dos semanas de la F-IV (FGF), iniciando 40 minutos después de la hipoxia/isquemia, previno la caída en la actividad de la colin-acetiltransferasa (CAT) en hipocampo y cuerpo estriado (figura 3b), y la disminución en los niveles de dopamina en el cuerpo estriado (figura 3a), (Datos no publicados).
Evaluaciones neurofisiológicas en el mismo modelo (tratadas con la F-IV a dósis de 30 µg/kg, 3 veces por semana durante 4 semanas) mostraron disminución en el número de asimetrías interhemisféricas en la potencia absoluta (PA), previno la disminución en los niveles de la potencia absoluta (PA) en las bandas “delta” y “theta”, la cual disminuyó importantemente en las ratas con hipoxia/isquemia no tratadas (tabla 1),(Aguilar et al 1993).
Lo anterior se ha interpretado como un efecto preventivo de la muerte neuronal y aumenta la actividad de las neuronas sobrevivientes; también mejoró la correlación lineal de los Potenciales Evocados Visuales en el segmento 80-316 ms (Aguilar et al 1993), sugiriendo que puede deberse a la permanencia de las vías y/o restablecimiento de ellas.
Toxicidad aguda
Se realizaron estudios en diferentes especies, (como ratón, rata y coballo) para determinar la dósis letal media (DL50), utilizando dósis hasta de 500 µg/kg, la cual supera en mucho las dósis útiles en rata (0.5 a 30 µg/kg) y no se generaron muertes, indicando que existe un margen terapéutico muy amplio.
Toxicidad crónica
Se utilizaron diferentes dósis, la más alta de 500 mg/kg aplicada 3 veces cada semana durante toda la vida del animal.
Al final se realizó la necropsia y un estudio histopatológico, dando especial interés a la búsqueda de neoplasias, hiperplasias y otras enfermedades proliferativas.
Los resultados finales mostraron que el grupo que recibió la adminiostración crónica a la dósis más alta de FGF, tuvo una mayor sobrevivencia que el grupo control, el cual recibió agua bidestilada como placebo y mostró igual sobrevivencia que los no tratados ni manipulados; no se detectaron neoplasias, hiperplasias, aumento de peso, volumen o talla en los animales tratados.
Lo anterior indica que el efecto del FGF en individuos sanos no ejerce un efecto notable, al menos en los parámetros evaluados, sugiriendo que la expresión de receptores de alta afinidad para éste factor está regulada y que sólo se expresan en la cantidad requerida para sobrevivencia y mantenimiento, a diferencia de cuando existe lesión, en la cual pueden aumentar notablemente, como acontece con otros factores neurotróficos.
Por lo tanto, cantidades excesivas de FGF no encontrarían receptores de alta afinidad a dónde a donde fijarse y no ejercerían efecto.
Evaluación mutagénica
La evaluación de la actividad mutagénica de un producto al que pudiera estar expuesto el ser humano, es un factor imprescindible para determinar las características toxicológicas, que a nivel genético pudiese representar dicho producto.
La importancia de éste estudio radica en la vinculación existente entre los eventos mutagénicaos que pudiesen presentarse dentro de las células y ciertos padecimientos de importancia médica, como el cáncer.
Actualmente existen metódologias desarrolladas en microorganismos en las que se evalua la capacidad genotóxica de los compuestos para establecer un riesgo potencial en el desarrollo del cáncer.
Una de las pruebas más utilizadas es la “Prueba de Ames”, ensayo que emplea varias cepas de “salmonella typhimurium” sujetas a manipulación genética que les confiere mayor sensibilidad en la detección de los mutágenos que ocasionan un corrimiento en el marco de la lectura del ácido desoxirribonucléico (ADN) o una sustitución de pares de bases.
La prueba es confiable, detectando más del 80% de los compuestos cancerígenos evaluados.
Los ensayos realizados en las cepas “TA 97a” , “TA 98″, “TA 100″ y “TA 102″, con y sin activación metábolica concluyeron que el Fibroblast Growth Factor (FGF), No presenta Actividad Mutagénica.
Farmacocinética y acceso al sistema nervioso central (snc) a través de la barrera hematoencefálica (bhe)
La administración intravenosa de aFGF y bFGF iodinados fué estudiada por Hondermarck et al (1990) mostrando una vida media en sangre de 30 segundos y una fijación rápida principalmente por riñon, hígado, bazo, gónadas y cerebro, la administración simultánea de Heparina disminuyó importantemente la fijación del FGF a los órganos mencionados, la fijación se realizó principalmente por los vasos sanguineos, lo cual sugiere que los heparansulfatos de la matriz extracelular de los vasos sanguineos rápidamente captan el FGF circulante.
l grupo IINEDEC ha utilizado Yodo-131 y Tecnecio-99 administrándolo en ratas Wistar por vía intraperitoneal y vena dorsal de la cola, encontrando resultados muy similares a los mencionados por Hondermark et al (1990), apreciando la captación por tiroides y confirmando la captación por cerebro.
El acceso al Sistema Nervioso Central (SNC) vía Barrera Hematoencefálica (BHE), al parecer es debido al transporte activo por células endoteliales utilizando moléculas acarreadoras, similarmente a lo que acontece con péptidos como la vasopresina y la tranasferrina, las cuales se tranportan en forma activa a través de la Barrera Hematoencefálica (BHE) (Banks et al 1987, Fishman et al 1987).
Evaluación inmunológica
La utilización eventual del FGF bovino en la clínica llevó a considerar los riegos inmunológicos que existen al administrar FGF bovino en otras especies, evaluando ésta sustancia en ratas Wistar, las cuales recibieron 2 aplicaciones de 30 mg/kg por semana durante 16 semanas (32 aplicaciones), los resultados evaluados por el método de ELISA mostraron ausencia de anticuerpoos contra el FGF.
Conclusiones
Las evidencias anteriores muestran que el bFGF y secundariamente el aFGF poseen un efecto Neurotrófico claro, manifestándose “in-vitro” sobre Neuronas de diferentes regiones del Sistema Nervioso Central (SNC) y contribuyendo “in-vivo” a la recuperación de parámetros Bioquímicos, Morfológicos y Electrofisiológicos en modelos de Daño Cerebral.
Los estudios Toxicológicos e Inmunológicos no mostraron evidencias de riegos.
Consideramos como “Contraindicación Absoluta” para la administración del Factor de Crecimiento Fibroblastico (FGF), la presencia de Gliomas, cáncer y enfermedades que cursen con Proliferación Anormal de Células Endoteliales.
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